数字PCR之“死体积”对定量结果的影响

预反应体积与反应体积之差称为死体积（dead volume）^【1】，其中预反应体积是指分区之前准备的初始体积，包括master mix、引物、探针以及待检测样本；反应体积是指被检测到的分区总体积n×Vp，n为分区总数，Vp为分区体积。

死体积一般是在分区过程中产生，如制备过程移液步骤过多、复杂管路设计、分区过程的挤压设计、分区后的稳定性等，有一些仪器的检测过程也会降低样品的利用率。

任何生物分析都存在二次抽样误差，只有部分样品被分析而不是全部，导致重复检测之间的统计差异。例如血液样本处理量可以达到几毫升，而dPCR检测体系一般只有几十微升。二次抽样是一个不可避免的误差来源，尤其是在样品中目标分子很少的情况下。由二次抽样引起的检测误差可以由以下公式（1）进行计算^【2】，其中m是二次取样中目标分子的数量，对于95%的置信度，Zc应为1.96。

（1）

图1 样本利用率与检测误差率的关系

图片来源：罗氏诊断整理

图1纵坐标表示误差超过25%的结果比例，横坐标表示用于分析的样本比例，图1的A中：蓝色表示目的基因λ=0.003，红色表示目的基因λ=0.015，黄色表示目的基因λ=0.03；图1的B中：蓝色为目的基因λ=0.001，红色为目的基因λ=0.005，黄色为目的基因λ=0.01。结果表明绝对误差超过25%的结果比例与样品利用率成负相关，既死体积越大，出现误差偏高的机率越大。

从一个简单的例子可以进一步解释死体积对dPCR检测结果，尤其是低拷贝模板的检出率的影响。

如图2^【4】所示：在不存在死体积的情况下，样本拷贝数为15，分区数量为15。如死体积率为5%，有效分区数约为14~15，样品检出率在12~15拷贝之间；如死体积率为25%，有效分区在11~12，样品检出率在4-15拷贝；死体积率为50%，则有效分区数为7~8，样品检出率为2~13拷贝。死体积率越高，检测结果的稳定性越低，检出限（LOD）也随之降低，这一效应在低拷贝样品中尤其明显。

图2 dPCR分区

图片来源：Journal of Food Protection, Vol. 74, No. 9, 2011, Pages 1404–1412.

与qPCR相比，dPCR检测过程需要经过分区这个过程，死体积率的出现不可避免，但死体积率与检测结果的稳定性和检出限成负相关，尤其是在检测低拷贝样品时需要重点关注dPCR系统的死体积率，尽可能选择死体积率低的系统，以保证结果的准确性。