数字PCR技术简史
PCR发展简史
在过去的 100 年里，很少有发明可以与PCR的重要性相提并论，因为它彻底改变了生物学和遗传学研究。Mullis注意到由于DNA 浓度不足导致 Sanger 测序在对单拷贝基因进行测序时产生的信号过于微弱，发明了一种以DNA双链复制原理为基础，对特定核酸样本进行体外扩增的生物技术，能够将微量的核酸样本迅速拷贝至几百万倍，便于后续的分析研究。PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）技术起源于20世纪70、80年代，经过几十年的发展，经历了第一代的终点法PCR、第二代荧光定量PCR和第三代数字PCR的演变，其应用从早期的生命科学研究迅速扩展到病原筛查诊断、遗传学分析、法医分析鉴定及食品卫生和环境检测等方面。
图1 PCR技术发展历程
20世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，将一个样本充分稀释，分配到不同的反应单元，每个单元包含少于或等于一个拷贝的目标分子( DNA模板) ，在每个反应单元中进行单独、平行的PCR反应，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，以实现绝对定量及稀有等位基因的检测。
与第一、二代PCR技术相比，数字PCR具有很多优势：一是特异性、灵敏性均有显著提高；二是在不依赖内参和标准曲线的前提下，可直接得到绝对量化指标；三是微反应单元相互独立、封闭，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，极大的提高了检测的准确度和可重复性。
图2 数字PCR示意图
图3 微反应单元数与数字PCR检测准确性
Ø信号区分度相关指标
数字PCR对模板的绝对定量是基于对每个微反应单元进行阴阳性判别后结合泊松统计计算而来，因此对于阴阳性微反应单元的准确识别，将会对数字PCR结果的准确性产生直接的影响。而在实际的检测中，经常碰到微反应单元阴阳性确定上的难题，如阴阳性信号界限不清，阳性信号簇不单一以及大量分布在阴阳信号之间的中间态（rain）的现象。
图4 阴阳性微反应单元难以确定。
图5 过高的中间信号微反应单元比例。
图6 扩增产物不单一
因此，在开展一项数字PCR检测实验的时候，我们需要对检测信号进行评估和分析，以便确定数据的有效性以及设计对应的优化方案。这些评估指标包括：Band width/tightness，SNR（signal to noise ratio），Rain percentage，RFI（relative fluorescent intensity），Peak resolution。
图7 数字PCR分辨率。
Band width/tightness：用于描述扩增后阴阳性微反应单元的荧光信号集中度，数值越低表示微反应单元间信号差异越小，扩增体系稳定性越好。
SNR（signal to noise ratio）：用于描述目标信号与噪音之间的比例。需要注意的是阳性和阴性信号均属于目标信号，需分别计算信噪比，与band width/tightness类似，主要用于评估信号的集中度。
Rain percentag：用于描述出现在阴性和阳性微反应簇之间部分的比例，通常是由于实验体系优化不佳导致，rain percentage应尽可能低，可通过体系优化实现。
RFI（relative fluorescent intensity）：用于评估阳性微反应簇和阴性微反应簇荧光强度的差值。RFI越大，说明阳性微反应单元与阴性微反应单元的区分度越好。
Resolution：以上指标均是从单一角度对数字PCR微反应单元的信号进行评估。分辨率是对阳性和阴性微反应单元区分程度的定量测量，由两个峰之间的荧光差异除以峰的组合宽度可得。
由上述公式可见，有效区分阴阳信号簇的理论最小值为2。分辨率越高，微反应单元被错误划分的可能性越低。影响数字PCR分辨率的因素很多，从硬件光路系统的性能，到反应体系的成分以及反应条件的选择，都会对检测分辨率造成直接的影响。
罗氏全新开发的Digital LightCycler系统将数字PCR提升到临床应用的新水平。Digital LightCycler系统将提供颠覆性组合：三种独特的纳米芯片、六通道多重检测功能、5倍浓缩的试剂预混液和高技术含量的光学元件。
图8罗氏Digital LightCycler 数字PCR系统
罗氏Digital LightCycler系统亮点
Ø高灵敏芯片- 20,000微孔：45µL超大上样体积，提高样本检出率
Ø通用芯片- 28,000微孔：适用于大多数基因表达，绝对定量等常规应用
Ø高分辨率芯片 - 100,000微孔：针对拷贝数变异等应用，可实现高分辨率的检出
Ø96个样本/检测运行
Ø最多支持6色荧光检测通道+1个专用的参考通道
系统数据表现
图9重复性&线性数据
数字PCR以明显的技术优势，已经广泛应用于核酸检测的方方面面。数字PCR在病原微生物检测，肿瘤液态活检，遗传生殖检测，公共卫生检测，环境微生物检测，RNA表达检测，NGS文库定量，甲基化检测等领域都发挥着越发重要的作用。工欲善其事，必先利其器，要想充分发挥数字PCR的性能优势，对数字PCR数据的评估是先决条件，只有建立起完善且严格的数字PCR检测流程，才能真正让蓬勃发展的分子诊断如虎添翼。
