PCR仪的计量特性及校准

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在运行PCR仪对样本扩增时，配置好反应体系（模板、引物、DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等），通过变性—退火—延伸三个基本的聚合酶链式反应步骤，以期得到特异性产物。扩增效果取决于反应体系和所用的PCR仪，当产物特异性不佳时，除反复调整PCR体系组成、优化反应条件外，确认PCR仪的性能也至关重要，当PCR仪使用年限长了之后，其热模块的帕尔贴、温度传感器精度和均热性能等都会有所下降。

普通（常规、定性）PCR仪的性能主要是与温度相关的计量特性，直接影响到样本扩增效果，依据JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》给出的普通PCR仪的计量特性主要有以下3个：

（1）温度的示值误差，即准确性，为PCR仪热模块的设定温度与标准器实测平均温度之差。温度准确性可以说是PCR仪最重要的性能指标，如变性步骤中温度过高，聚合酶活性有降低、甚至失活的风险；在退火步骤中如实际温度低，非特异性扩增概率加大，尤其是在热循环刚开始时，非特异性产物的负面影响更大。

（2）温度均匀度，即热模块内标准器15个孔的实测温度最大值与最小值之差。由于 PCR仪帕尔贴元件加热不均匀和均热性能不一，导致 PCR仪模块上各孔间存在一定温差，尤其是多孔板的边缘部分，易造成实验结果偏差。

（3）升降温速度，即升温、降温程序中，热模块平均时间上升或下降的温度值，升温和降温分别对应热模块的加热和冷却程序。常见有4℃/s，更高的速度可以让样品更快达到期望的温度。

谈及PCR仪的校准之前，先讲下PCR仪的控温模式，以常用的Tube模拟控温模式为例进行说明，运行中需要设定反应体系的体积，仪器通过内置算法计算对样品的温度以及达到设定温度所需的时间，在加热或冷却的过程中，通常会适当过冲让模块温度超出设定值。这样可以确保样品尽快达到设定的温度、而自身不会发生过冲。

在PCR仪实际校准中，所用标准器传感器是紧密贴合在96孔内壁的，实测温度是加热模块金属槽的温度，是无法直接测量反应体系的温度，样品实际的温度变化相对于模块本身会有滞后性，也存在一定的偏差。

对于常规的PCR，我们依据JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》给出30℃、50℃、60℃、70℃、90℃和95℃的温度示值误差、均匀性，以及升降温速度。下图为我们实际校准工作中一台PCR仪的温度实时曲线，可以看到有着较明显的温度过冲现象。